高爾基體膜蛋白提取試劑盒

2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

WB,IP等

動物細胞/組織

1.使用方便，從細胞，組織中提取蛋白不需經過研磨、反復凍融、超聲破碎等前處理。
2.提取過程簡單方便。
3.含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。
4.紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。
5.總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結合釋出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.離心機
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 實驗過程中的所有試劑須預冷；所有器具須放-20℃冰箱預冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是高爾基體蛋白回收率會下降。
? 用Dounce勻漿器勻漿是高爾基體膜蛋白提取的關鍵的步驟，故勻漿前先通過預實驗確定不同組織樣本的勻漿次數，方法是每勻漿 5-10 次后，取 2-3 μl 勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細胞數量降低到 20%以下為佳。此鏡檢步驟非必須步驟，但是會影響高爾基體膜蛋白的回收率。在樣本極難獲取的實驗中，務必做鏡檢。
? 提取液C在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導致不容易分層。
? 膜蛋白電泳時loading buffer應該避免煮沸。
? 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。

細胞高爾基體膜蛋白提取：
1. 提取液制備：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取1-2×107個細胞，在4℃，500×g條件下離心2-3分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集細胞。
3. 用冷PBS洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 加入500 μl冷的試劑 A，置冰上10分鐘。
5. 用Dounce勻漿器勻漿充分勻漿。
6. 然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。
7. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
8. 在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。
9. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
10. 在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。
11. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
12. 在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。
13. 在沉淀中加入400 μl冷的試劑B，混勻。
14. 在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。
15. 棄上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，充分混勻。
16. 在2-8℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。
17. 在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
18. 將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。
19. 在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30μl。
20. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。
21. 用50-100 μl冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。
22. 將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

組織高爾基體膜蛋白提取：
1. 提取液制備：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取50-100 mg新鮮動物組織樣本，用PBS洗滌干凈。
3. 用剪刀盡可能剪碎，用冷PBS洗滌兩次。
4. 加入500 μl冷的試劑 A，置冰上10分鐘。
5. 用Dounce勻漿器充分勻漿30-40下，至無明顯固體團塊。
6. 然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。
7. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
8. 在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。
9. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
10. 在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。
11. 棄沉淀，將上清吸入另一預冷的干凈離心管。
12. 在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。
13. 在沉淀中加入400μl冷的試劑B，混勻。
14. 在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。
15. 棄上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，混勻。
16. 在4℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。
17. 在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
18. 將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。
19. 在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30μl。
20. 小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。
21. 用50-100 μl冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。
22. 將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實驗。

1.蛋白濃度低？
處理部分樣本時可能沒有裂解，導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑C的處理時間即可。在持續振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑C中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結構，沒有對蛋白質之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構象和活性。

1.Jialin He et al.
Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells Alleviate Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury Via Golgi Apparatus Secretory Pathway Ca2+ -ATPase Isoform1
Frontiers in Cell and Developmental Biology 2020 （IF=5.201）